Su ve İçecek Mikrobiyolojisi
İçecek üretimlerinde Bacillus cereus analizi
Ersin YILDIZ / 07-2021 - rev1 www.beverageandwater.org ersin.yildiz@outlook.com
1. GİRİŞ
Bacillaceae familyasının Bacillus cinsine ait bir bakteri olan Bacillus cereus, toprak ve bitki örtüsü üzerinde yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Santral veya subterminal yapıda, elipsoidal sporlara sahip olan bakteri, peritrik flegellaları sayesinde hareketli ve aerobiktir.(3)
Toprak kökenli sporlu bakteri olduğu için rüzgâr ile her yere kolaylıkla taşınabilir. Minimal enfeksiyon dozu değişik yayınlarda; 103-107 /g olarak verilmektedir.(2)
B. cereus gıda zehirlenmesinde aracı gıdalar olarak; pişmiş pirinç, makarna, et, kümes hayvanları etleri, sebze yemekleri, patates püresi, çeşitli çorbalar, pudingler, baharat ve soslar sayılabilir. Ayrıca, toprak kökenli olması nedeni ile tarla ve bahçe ürünlerine rahatlıkla bulaşabilen B. cereus, sporlu bir bakteri olduğu için et ve süt ürünlerinde de bulunabilir.(1)
Optimum gelişme sıcaklığı, suşlara göre 28–35 oC arasında değişmekle birlikte genellikle 30 oC'dir. En yüksek üreme sıcaklığı yine suşlara göre 37–48 oC arasında değişir. En düşük üreme sıcaklığı da suşa bağlı olarak 10–18 oC arasındadır. Bazı kaynaklarda en düşük sıcaklık 4–5 oC, en yüksek sıcaklık ise 50 oC olarak verilmektedir. Spor germinasyonu için gereken optimum sıcaklık 30 oC, minimum -1 oC ve maksimum 59 oC'dir. Gelişebildiği pH aralığı 4,9–9,3 olup optimum 7,0'dir.(3)
Bacillus cereus; lesitinaz, jelatinaz, proteaz ve amilaz aktivitesine sahip olup nitrat redüksiyonu pozitif ve polimiksine dirençlidir. Birçok suşu %7,5 tuzda üreyebilir. (3)
B. cereus'un çok sayıda alınması ile bireylerde gıda zehirlenmesi görülebilir. Özellikle B. cereus ile kontamine olmuş gıdalar pişirildikten sonra yeterince ve hızlı soğutulmadıklarında veya gıdaların hazırlanması ile tüketimi arasındaki süre uzadığında, canlı ve ısıya dirençli olan sporların çimlenmesi sonucu mikroorganizma çoğalıp, gıda zehirlenmesine neden olabilecek düzeyde toksin oluşturabilir. (3)
Bacillus cereus iki farklı toksin oluşturur. Bunlardan birisi; sıcaklığa dayanıklı (Stabil Toxin; ST) bir protein olan enterotoksindir. Gıda zehirlenmesine neden olan bu toksin 126 oC'de 90 dakikada inaktif hale gelir. Diğer toksin ise; sıcaklığa dayanıksız (Labil Toxin; LT) olan bir peptittir. 60 oC'de birkaç dakikada tahrip olur. Bacillus cereus türündeki bütün suşların toksin yapmadığı, belli serotiplerin toksin oluşturduğu bilinmektedir.(3)
B. cereus sporları hidrofilik olmalarından dolayı kolayca çelik, cam ve lastik yüzeylere yapışırlar ve yüzeylerdeki kısa temizleme programları bütün sporları elemine etmeyebilir. Yüzeylere tutunan sporların, eriyik içindeki sporlara kıyasla dezenfektan ile elemine edilmesi daha zordur. Birçok B. cereus sporu sütte ısıl aktivasyondan sonra hızlıca çimlenir ve uygun koşullar bulup çoğaldıklarında, çelik, cam ve lastik yüzeylerde oluşturdukları biyofilm formunda elimine edilmeleri son derece zordur.(3)
2. ANALİZ ve DOĞRULAMA
2.1. Standarta Uygun Besiyeri Seçimi ve Değerlendirme
Standart analiz yöntemi katı besiyerinde koloni saymaktır. Amaca göre EMS yöntemi ile sayım ya da var/yok testleri de yapılabilir.(1)(2)
İşletme laboratuvarlarında B. cereus 'un rutin analizleri için Cereus Selective Agar; MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) Agar ve Bacillus cereus Selective Agar; PEMBA (Polimiksin Egg Yolk Mannitol Bromtimol Blue Agar) olmak üzere iki ticari besiyeri yaygın olarak kullanılmaktadır.(3)
Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO); ISO 7932:2004 Standartdı’nda MYP agar’da 30 oC’de inkübasyon koşulunu önermektedir.
2.2. Katı Besiyerinde Sayım
Yayma yöntemi ile yapılan standart sayım yöntemidir. Homojenizasyon ve gerekli ise seyreltiler yapıldıktan sonra Mannitol egg Yolk Polymyxin (MYP) agar besiyerine ekim yapılır.(1)(2)
MYP agar besiyerinde B. cereus kolonileri tipik olarak büyük, pembe ve lesitinaz aktivitesine bağlı olarak koloni etrafında presipitasyon zonu oluşturur.(1)
10–2 ile 10–6 arasında hazırlanan seri dilüsyonlardan MYP Agar besiyerine ekim yapılarak 30-35 oC'de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. MYP Agar besiyeri, B. cereus 'un lesitinaz aktivitesi ve mannitol fermantasyonu olmak üzere iki tipik reaksiyonu belirlemek üzere geliştirilmiştir.(3)
B. cereus sayısının az olduğu tahmin edilen sıvı gıdalarda doğrudan, katı veya yarı katı gıdalarda ise 10–1 dilüsyonlardan ekim yapılır. Böyle ürünlerde bakteriyi saptama oranını artırmak için 140 mm çaplı Petri kutularına 1 mL inokülüm aktarılarak da ekim yapılır.(3)(2)
B. cereus mannitol negatif olduğu için, MYP Agar besiyerinde pembe koloniler oluştururken, lesitinaz aktivitesi nedeni ile de koloni, etrafında presipitasyon (çökelme) halkası oluşumuna neden olur. Ancak bu besiyerinde bazı dezavantajlar da vardır. İncelenecek gıda maddesinde mannitolü fermente ederek asit oluşturabilen farklı mikroorganizma grupları mevcut ise, B. cereus kolonilerinin karakteristik pembe renkleri azalır veya tamamıyla kaybolur. Bazı Bacillus türleri, çok az lesitinaz üretir veya hiç üretmezler. Bu türlere ait kolonilerin etrafında presipitasyon halkası gözlenmez.(3)
2.3. EMS Yöntemi ile Analiz
En düşük dilüsyondan ekim yapılmış olan Petri kutularındaki karakteristik koloni sayısı 15'ten az olarak tahmin ediliyor ise EMS yöntemi kullanılarak sayım yapılabilir. Bu amaçla FDA (Food and Drug Administration) tarafından belirtilen yönteme göre Tripticase Soy (CASO) Polimiksin Broth içeren tüplere inokülasyon yapılarak, 30 oC'de 48 saat inkübasyona bırakılır. B. cereus için tipik olan yoğun gelişme gözlenen pozitif tüplerden MYP Agar besiyerine alınarak, 30 oC'de 24–48 saat inkübe edilir. Burada oluşan ve B. cereus olduğu tahmin edilen tipik koloniler B. cereus doğrulaması için yatık Nutrient Agar besiyerine alınarak biyokimyasal testlere geçilir.(3)(2)
Refakatçi floranın yoğun olduğu örneklerde pastörizasyon uygulaması ile spor oluşturmayan ve/veya ısıl işleme dirençsiz mikroorganizmaların inhibisyonu ve bu şekilde agarlı besiyerinde bunların koloni oluşturmaları önlenir. Pastörizasyon normu çok değişkendir ve ISO'ya göre 70 oC'de 15 dakika, yine ISO'ya göre EMS yöntemi ile yapılacak sayımda 80 oC'de 10 dakika şeklindedir.(3)
2.4. Var/Yok Analizi
Amaca göre gereken miktar gıda numunesi, x9 misli Tripticase Soy (CASO) Polimiksin Broth besiyerinde homojenize edilip 30 oC'ta aerobik koşullarda 21 ±3 saat inkübasyona bırakılır. Besiyerinde bulanıklık oluşursa MYP agara sürme yapılıp standart yöntemle devam edilir.(2)
2.5. Membran Filtrasyon Yöntemi (HGMF Tekniği) ile Analiz
Hidrofobik Grid Membran Filitre (HGMF) tekniği, özellikle su ve diğer sıvı gıdaların analizinde kullanılmaktadır. Bu teknikte örnek önce bir membran filitreden geçirilerek mikroorganizmalar filitre üzerinde tutulmaktadır. Daha sonra bu filitreler uygun bir besiyeri üzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilmekte ve oluşan koloni sayısından materyaldeki mikroorganizma sayısı hesaplanmaktadır. Filitreler üzerinde bulunan birbirini dik kesen hidrofobik hatlar, oluşan kolonilerin dağılmasını önlemekte ve böylece sayım yapılmasını kolaylaştırmaktadır.(6)
Membran filitrasyon tekniğinin bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bunlardan en önemlileri; örnekte az sayıda mikroorganizmanın bulunması durumunda bile belirleme imkanı vermesi ve inkübasyondan sonra filitrelerin kurutularak saklanabilmesidir. (6)
Membran filtrasyon yöntemin’de özellikle içecek numunelerinde, örneklerin süzülmesi zaman zaman sorun olabilmektedir. Numune su gibi saf olmadığı için, hızlıca filtrenin tıkanmasına neden olabilir ve süzme işlemi tamamlanamayabilir. Bunun yanında, filte üzerindeki birikinti nedeniyle sonuçların okunması ve kolonilerin sayılması zor olabilir. Buna bir çözüm olarak çift aşamalı süzme düzeneği kullanılabilir. Bunun için; mevcut Membran filtre düzeneğiyle uyumlu bir Prefiltre ataçmanı temin edilmelidir. Bu prefiltre ataçmanına numuneye göre 5 – 10 μ’luk selüloz nitrat filtre takılır. Numune önce üst haznedeki prefiltre kısmında süzülür, askıdaki materyal burada birikir ve daha berraklaşmış olan sıvı alt haznedeki 0.45μ mikrobiyal filtrede süzülmüş olur.
Bu ön filtrasyon ataçmanı’nın maliyeti ise Sartorius 16807 için yaklaşık 350 – 400 Euro/adet civarındadır.
2.6. Bacillus cereus İdentifikasyonu
İdentifikasyon için her bir MYP Agar besiyerinden B. cereus olduğu tahmin edilen 5 veya daha fazla sayıda pembe renkli, lesitinaz pozitif koloni seçilir. Petri kutusundaki koloni sayısı 5 adetten az ise, bulunan muhtemel kolonilerin tamamı alınır. Koloniler çok sayıda ve yığın halinde olup tek koloni seçimi mümkün değilse, MYP Agar besiyerinde bulunan 5 şüpheli koloniden tek koloni düşürebilmek için sürme yapılarak 30 oC'de 18–24 saat inkübasyona bırakılır ve ardından muhtemel koloniler seçilir.(3)
B. cereus’u; aynı gruptaki B. antrhacis, B. thuringiensis, B. mycoides ile ayrımı için; glikozun anaerobk kullanımı, Voges Proskauer (VP) ve Nitrat testleri yapılır.(4)
Glikoz Testi
Dextrose Casein-Peptone Agar (Merck 1.10860) besiyerinde yapılabilir. Tüplerde sterilize edilmişbesiyeri standart analizyöntemine göre kullanımdan hemen önce kaynarsu banyosunda tutularak eritilir ve tekrar hızla dik pozisyonda 30 oC'a soğutulur. Bu işlemde amaç besiyeri içinde bulunan oksijenin uzaklaştırılmasıdır. Bacilluscereus olduğundan kuşku duyulan kolonilerden elde edilen saf agar kültüründen 1 koloni alınarak aşı iğnesi ile 1 defada Dextrose Casein- PeptoneAgar besiyerine daldırma yapılır.30 oC'da 24 saat inkübasyon sonunda tüpün tümünün sarı renk almasıpozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. B. cereus butestte pozitif sonuçverir.(4)
Voges-Proskauer Testi
MR-VP Broth (Merck 1.05712) besiyerine saf agar kültüründen alınan bir koloni aşı özesi ile aşılanır. 30 oC'da 24 saat inkübasyon sonunda standart Voges-Proskauer testi ile sonuç alınır. B. cereus VP pozitif bir bakteridir. VP testi için 1 ml kültür temiz bir test tüpüne alınır, üzerine 0,2 ml % 40 potasyum hidroksit (Merck 1.05033) çözeltisi, 0,6 ml %5 a--naftol (Merck 1.06223) çözeltisi ve birkaç kreatin kristali ilave edilir. Kuvvetlice çalkalanıp oda sıcaklığında 1 saat bırakılır. Pembe renk oluşumu VP testinin pozitif olduğunu gösterir. Reaksiyon sonucu negatif ise orijinal tüp 24 saat daha inkübe edilip tekrar VP testi yapılır. Kreatin kristalleri kullanılmadan da VP testi yapılabilir.(4)
Nitrat Testi
Nitrat Broth (Merck 1.10204) besiyeri kullanılabilir. B. cereus olduğundan kuşku duyulan kolonilerden elde edilen saf agar kültüründen 1 koloni alınarak aşı özesi ile besiyerine inoküle edilip 30 oC'da 24 saat inkübasyona bırakılır. Bu sürenin sonunda tüpe 0,2-0,5 ml olacak şekilde birkaç damla Griess-Ilosvay's nitritçözeltisi (Merck 1.09023)ilave edilir. 15 dakika içinde kırmızı renk oluşumu nitratın nitrite indirgendiğinin göstergesidir.(4)
Oluşan nitrit miktarı fazla ise renk sarıya dönüşebilir. Negatif reaksiyon alınır ise bu sonuç ya nitratın nitrite indirgenmediğini ya da nitratın indirgenmesi sonundan oluşan nitritin daha ileri aşamada nitrojen veya amonyuma indirgendiğinin göstergesidir. İkinci olasılık çinko tozu testi ile saptanabilir. Test tüpüne az miktarda (spatülün ucu ile ; 0,1 g kadar) çinko tozu (Merck 1.08774) ilave ettikten sonra kültür çinko tozunun çökmesi için 10 dakika kendi halinde(karıştırmadan) bırakılır. Bu süre sonundaçinko tozu etrafındapembe renk oluşumuçinko tozu reaksiyonu pozitif olarak değerlendirilir ve bu sonuç nitratın nitrite indirgenmediğini gösterir. Bir diğer deyiş ile çinko tozu reaksiyonu pozitif olduğunda nitrat testi negatifolarak değerlendirilir. Tersine olarak çinko tozu etrafında pembe renk oluşmaması bu testin negatif olarak değerlendirilmesine neden olur. Yani nitrat nitriteve daha ileri aşamada amonyum veya nitrite indirgenmiştir. Dolayısı ile çinko tozu reaksiyonu negatif olduğunda nitrat testi pozitif olarakdeğerlendirilir. B. cereusnitratı nitrite indirger. (4)
YARARLANILAN KAYNAKLAR
(1) ARICI Muhammet, Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, Yıldız Teknik Ünv. İstanbul.
(2) HALKMAN A. Kadir, Gıda Mikrobiyolojisi, 2019. Editör: A. Kadir Halkman. Başak Matbaacılık ve Tanıtım Hizmetleri Ltd, 648 s. ISBN: 978-605-245-683-5, Ankara.
(3) KALKAN Selin, 2006. Çiğ sütte Bacillus cereus sayılması için yöntem modifikasyonları üzerine çalışmalar, Ankara Ünv. Gıda Müh. Analibilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Ankara.
(5) ISO 7932:2004, Gıda ve hayvan yemlerinin mikrobiyolojisi - Varsayımsal Bacillus cereus sayımı için yatay yöntem
(6) Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, Ankara Ünv. Ziraat Fak. Gıda Müh. Bölümü