Bacillus cereus Analizi

Su ve İçecek Mikrobiyolojisi

202107-Bacillus-cereus-Analizi

.pdf

Download PDF • 1.37MB

İçecek üretimlerinde Bacillus cereus analizi

Ersin YILDIZ / 07-2021 - rev1 www.beverageandwater.org ersin.yildiz@outlook.com

1. GİRİŞ

Bacillaceae familyasının Bacillus cinsine ait bir bakteri olan Bacillus cereus, toprak ve bitki örtüsü üzerinde yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Santral veya subterminal yapıda, elipsoidal sporlara sahip olan bakteri, peritrik flegellaları sayesinde hareketli ve aerobiktir.(3)

Toprak kökenli sporlu bakteri olduğu için rüzgâr ile her yere kolaylıkla taşınabilir. Minimal enfeksiyon dozu değişik yayınlarda; 103-107 /g olarak verilmektedir.(2)

B. cereus gıda zehirlenmesinde aracı gıdalar olarak; pişmiş pirinç, makarna, et, kümes hayvanları etleri, sebze yemekleri, patates püresi, çeşitli çorbalar, pudingler, baharat ve soslar sayılabilir. Ayrıca, toprak kökenli olması nedeni ile tarla ve bahçe ürünlerine rahatlıkla bulaşabilen B. cereus, sporlu bir bakteri olduğu için et ve süt ürünlerinde de bulunabilir.(1)

Optimum gelişme sıcaklığı, suşlara göre 28–35 oC arasında değişmekle birlikte genellikle 30 oC'dir. En yüksek üreme sıcaklığı yine suşlara göre 37–48 oC arasında değişir. En düşük üreme sıcaklığı da suşa bağlı olarak 10–18 oC arasındadır. Bazı kaynaklarda en düşük sıcaklık 4–5 oC, en yüksek sıcaklık ise 50 oC olarak verilmektedir. Spor germinasyonu için gereken optimum sıcaklık 30 oC, minimum -1 oC ve maksimum 59 oC'dir. Gelişebildiği pH aralığı 4,9–9,3 olup optimum 7,0'dir.(3)

Bacillus cereus; lesitinaz, jelatinaz, proteaz ve amilaz aktivitesine sahip olup nitrat redüksiyonu pozitif ve polimiksine dirençlidir. Birçok suşu %7,5 tuzda üreyebilir. (3)

B. cereus'un çok sayıda alınması ile bireylerde gıda zehirlenmesi görülebilir. Özellikle B. cereus ile kontamine olmuş gıdalar pişirildikten sonra yeterince ve hızlı soğutulmadıklarında veya gıdaların hazırlanması ile tüketimi arasındaki süre uzadığında, canlı ve ısıya dirençli olan sporların çimlenmesi sonucu mikroorganizma çoğalıp, gıda zehirlenmesine neden olabilecek düzeyde toksin oluşturabilir. (3)

Bacillus cereus iki farklı toksin oluşturur. Bunlardan birisi; sıcaklığa dayanıklı (Stabil Toxin; ST) bir protein olan enterotoksindir. Gıda zehirlenmesine neden olan bu toksin 126 oC'de 90 dakikada inaktif hale gelir. Diğer toksin ise; sıcaklığa dayanıksız (Labil Toxin; LT) olan bir peptittir. 60 oC'de birkaç dakikada tahrip olur. Bacillus cereus türündeki bütün suşların toksin yapmadığı, belli serotiplerin toksin oluşturduğu bilinmektedir.(3)

B. cereus sporları hidrofilik olmalarından dolayı kolayca çelik, cam ve lastik yüzeylere yapışırlar ve yüzeylerdeki kısa temizleme programları bütün sporları elemine etmeyebilir. Yüzeylere tutunan sporların, eriyik içindeki sporlara kıyasla dezenfektan ile elemine edilmesi daha zordur. Birçok B. cereus sporu sütte ısıl aktivasyondan sonra hızlıca çimlenir ve uygun koşullar bulup çoğaldıklarında, çelik, cam ve lastik yüzeylerde oluşturdukları biyofilm formunda elimine edilmeleri son derece zordur.(3)

2. ANALİZ ve DOĞRULAMA

2.1. Standarta Uygun Besiyeri Seçimi ve Değerlendirme

Standart analiz yöntemi katı besiyerinde koloni saymaktır. Amaca göre EMS yöntemi ile sayım ya da var/yok testleri de yapılabilir.(1)(2)

İşletme laboratuvarlarında B. cereus 'un rutin analizleri için Cereus Selective Agar; MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) Agar ve Bacillus cereus Selective Agar; PEMBA (Polimiksin Egg Yolk Mannitol Bromtimol Blue Agar) olmak üzere iki ticari besiyeri yaygın olarak kullanılmaktadır.(3)

Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO); ISO 7932:2004 Standartdı’nda MYP agar’da 30 oC’de inkübasyon koşulunu önermektedir.

2.2. Katı Besiyerinde Sayım

Yayma yöntemi ile yapılan standart sayım yöntemidir. Homojenizasyon ve gerekli ise seyreltiler yapıldıktan sonra Mannitol egg Yolk Polymyxin (MYP) agar besiyerine ekim yapılır.(1)(2)

MYP agar besiyerinde B. cereus kolonileri tipik olarak büyük, pembe ve lesitinaz aktivitesine bağlı olarak koloni etrafında presipitasyon zonu oluşturur.(1)

10–2 ile 10–6 arasında hazırlanan seri dilüsyonlardan MYP Agar besiyerine ekim yapılarak 30-35 oC'de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. MYP Agar besiyeri, B. cereus 'un lesitinaz aktivitesi ve mannitol fermantasyonu olmak üzere iki tipik reaksiyonu belirlemek üzere geliştirilmiştir.(3)

B. cereus sayısının az olduğu tahmin edilen sıvı gıdalarda doğrudan, katı veya yarı katı gıdalarda ise 10–1 dilüsyonlardan ekim yapılır. Böyle ürünlerde bakteriyi saptama oranını artırmak için 140 mm çaplı Petri kutularına 1 mL inokülüm aktarılarak da ekim yapılır.(3)(2)

B. cereus mannitol negatif olduğu için, MYP Agar besiyerinde pembe koloniler oluştururken, lesitinaz aktivitesi nedeni ile de koloni, etrafında presipitasyon (çökelme) halkası oluşumuna neden olur. Ancak bu besiyerinde bazı dezavantajlar da vardır. İncelenecek gıda maddesinde mannitolü fermente ederek asit oluşturabilen farklı mikroorganizma grupları mevcut ise, B. cereus kolonilerinin karakteristik pembe renkleri azalır veya tamamıyla kaybolur. Bazı Bacillus türleri, çok az lesitinaz üretir veya hiç üretmezler. Bu türlere ait kolonilerin etrafında presipitasyon halkası gözlenmez.(3)

2.3. EMS Yöntemi ile Analiz

En düşük dilüsyondan ekim yapılmış olan Petri kutularındaki karakteristik koloni sayısı 15'ten az olarak tahmin ediliyor ise EMS yöntemi kullanılarak sayım yapılabilir. Bu amaçla FDA (Food and Drug Administration) tarafından belirtilen yönteme göre Tripticase Soy (CASO) Polimiksin Broth içeren tüplere inokülasyon yapılarak, 30 oC'de 48 saat inkübasyona bırakılır. B. cereus için tipik olan yoğun gelişme gözlenen pozitif tüplerden MYP Agar besiyerine alınarak, 30 oC'de 24–48 saat inkübe edilir. Burada oluşan ve B. cereus olduğu tahmin edilen tipik koloniler B. cereus doğrulaması için yatık Nutrient Agar besiyerine alınarak biyokimyasal testlere geçilir.(3)(2)

Refakatçi floranın yoğun olduğu örneklerde pastörizasyon uygulaması ile spor oluşturmayan ve/veya ısıl işleme dirençsiz mikroorganizmaların inhibisyonu ve bu şekilde agarlı besiyerinde bunların koloni oluşturmaları önlenir. Pastörizasyon normu çok değişkendir ve ISO'ya göre 70 oC'de 15 dakika, yine ISO'