Su ve İçecek Mikrobiyolojisi
Su ve içecek üretimlerinde; Koliform, Fekal koliform ve E.coli analizi
Ersin YILDIZ / 07-2021 - rev1 www.beverageandwater.org ersin.yildiz@outlook.com
1. GİRİŞ
Gıda mikrobiyolojisinde en önemli grup hiç kuşkusuz koliformlardır. Koliform grup bakteriler denildiğinde 37oC'ta 48 saat içinde laktozdan asit ve gaz oluşturan, gram negatif, sporsuz ve çubuk şeklinde olan bakteriler anlaşılır. Bu tarife göre Enterobacteriaceae üyeleri olan E. coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii ve Klebsiella pneumoniae koliform grup bakteriler olarak tanımlanmış olur. Enterobacteriaceae üyelerinin tümü glikozdan asit ve gaz oluştururlar.(1)
Bu grup üyelerinden E. coli dışındakiler, genellikle bitki/ toprak kaynaklıdır. E. coli ise doğada sadece sıcakkanlı hayvanların bağırsak sistemlerinde bulunduğu için gıda, çevre vb. numunelerde bu bakteriye rastlanması, doğrudan fekal (dışkı ile) bulaşmaya işaret eder. E. coli dışındaki koliform grup bakteriler arasında da dışkı kaynaklı olanlar vardır. Bunların tümü fekal koliform grup olarak tanımlanır.(1)
Escherichia coli (E.coli) dışındaki koliform grup üyelerinden bitki/ toprak kaynaklı olanlar 44,0±0,1oC'ta gelişemez. Fekal kontaminasyonun (bulaşmanın) göstergesi olarak E. coli, en çok başvurulan bakteri olmakla birlikte bazı numunelerde E. coli olmasa bile diğer fekal koliformlara rastlanılmaktadır. Dolayısıyla uluslararası ticarette kimi zaman E. coli yerine fekal koliform varlığı araştırılmaktadır. Basit olarak, ekimi yapılmış VRB agar 44±0,1oC'ta 24 saat inkübe edilir. Tipik koliform kolonileri fekal koliform olarak değerlendirilir ve tür tayinine gidilmesi gerekli değildir, analiz edilen numuneye doğrudan ya da dolaylı olarak sıcakkanlı hayvan dışkısı bulaşmıştır.(1)
Koliform grup bakteriler, gıdalarda hijyen indikatörü olarak değerlendirilir. Grup üyeleri içinde primer patojen E. coli O157:H7 serotipi ile fırsatçı patojenler de bulunmaktadır. Bu nedenle gıdalarda koliform grup bakteri sayısının yüksek olması istenmez. Bazı gıdalarda belirli bir miktar numunede "yok" olması hedef alınırken pek çok gıdada bitki ve toprak kökenli koliformların belirli sayılarda bulunmasına izin verilmektedir. Buna göre koliform grup analizinde sayım ya da var/yok testleri uygulanır.(1)
Gıda sanayisinde tartışmalara neden olan bir konu; "Klebsiella pneumoniae gibi fırsatçı patojenlere gıda numunesinde rastlandığında sağlık açısından nasıl bir yargıya varılacağıdır". Bir bakış açısına göre bu bakterinin rastlandığı gıda, bakteri sayısına bakılmaksızın insan sağlığı açısından tehlikeli olarak yorumlanır. Tersine olarak, çeşitli ulusal ve uluslararası standartlarda bazı gıdalarda E. coli hariç olmak üzere koliform bakterilerin <100kob/g (kob/ml) sayıda bulunmasına izin verilir. Bu durumda bir katı besiyerinde ya da EMS yöntemiyle yapılan sayımda tür tanımlamasına gitmek gerekli değildir. Bu bakış açısına göre, fırsatçı patojen olarak değerlendirilse bile bir gıdada örneğin, 90 kob/g(ml) Klebsiella pneumoniae saptanırsa sorun yoktur.(1)
E. coli denildiğinde tam olarak standart E. coli biyotip 1 anlaşılır. İndol negatif E. coli biyotip 2 nadir görülür, ancak bu da fekal kontaminasyonu gösterir. Bunlar, insanlarda ender olarak hastalıklara neden olurlar.(1)
Koliform grup bakterilerin analizinde inkübasyon sıcaklığı olarak yaygın bir şekilde 35-37oC kullanılmakla beraber, uluslararası kuruluşlar tarafından 30-37oC (ISO 4831) ve süt ürünleri analizi için 32 oC (FDA) inkübasyon sıcaklığı da önerilmektedir. Bunlardan 30-32oC genel olarak proses kontrolü, 35-37oC ise ürünün potansiyel sağlık riski taşıyıp taşımadığının belirlenmesi amacıyla seçilir.(1)
Koliform grup bakteri analizlerinin çoğunda bu grubun laktozdan asit oluşturma özelliği esas alınır. Örneğin, koliform bakterilerin laktozdan asit oluşturması sonucunda VRB agar bileşimindeki pH indikatörü, kolonilerin koyu kırmızı renk oluşturmasını sağlar. Bazı gıdalarda başta glikoz olmak üzere laktozdan başka şekerler de vardır. Özellikle sıvı ve 1 mL ekim yapılan bu gıdalarda koliform grup olmayan bazı bakteriler, laktoz dışındaki şekerlerden asit oluşturarak sahte pozitif sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle atipik görünümde olan koloniler ayrı ayrı brilliant green bile (BGB) brotha ekilerek burada 35-37 oC'ta 24 saat içinde gaz oluşumu kontrol edilmelidir. Bu kontrol, yöntemin doğruluğunu onaylamak için 3'er ay aralıklarla tipik kolonilere de uygulanmalıdır.
Koliform grup bakteri analizlerinde esas alınan bir diğer özellik laktozdan gaz oluşturma özelliğidir. Buna göre, lauryl sulfate (LST) broth ve BGB broth besiyeri tüplerindeki Durham tüplerinde biriken gaz, koliform grup bakteriler için tipik reaksiyon olarak değerlendirilir. Bu besiyerlerinde, Enterobacteriaceae üyeleri başta olmak üzere, koliform grup dışında bazı bakteriler de gaz oluşturmadan gelişebilir. Bu nedenle koliformlar için tipik reaksiyon gelişmeye bağlı bulanıklık ve Durham tüpünde gaz görülmesidir.(1)
Fekal koliformlar; dezenfektanlara, bazı boya (Malaşit yeşili, Fuksin gibi) maddelerine, safra ve safra tuzlarına ve %7 NaCl’ye karşı duyarlıdır. Isı ve soğuğa karşı ise dirençlidir.
E. coli serotiplerinin % 98-99 kadarı β-D-glucuronidase enzimi ihtiva eder. Diğer bakterilerde çok ender görülen bu enzim 4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide (MUG) substratını parçalar ve parçalama ürünlerinden 4- methylumbelliferone uzun dalga boylu (366 nm) UV lambası ile floresan ışıma verir.
Fekal Koliformların en tipik üyesi Escherichia coli’dir. Gram (-), sporsuz, fakultatif anaerob, basil (çubuk) şekilli bakterilerdir. Kapsül oluşturma nadirdir. 44.5oC’de üreyebilmeleri ile diğer koliformlardan ayrılırlar.
E.coli; peptonlu su, buyyon ve jeloz gibi zenginleştirilmemiş besiyerlerinde fakültatif anaerop olarak ürer. Optimal üreme 37°C'de, nötral pH varlığında olur. Ancak 18- 44.5°C arasında, pH 5- 8 sınırlarında da daha yavaş olarak ürer ve 44°C' de laktozu fermente edebilmesi ve indol oluşturması diğer laktozu fermente eden bakterilerden ayırt edilmesinde kullanılır. Sıvı besiyerlerinde ürediğinde homojen bulanıklık meydana getirir. Katı besiyerlerinde ise 24 saatte düzgün kenarlı, ortası kalkık, 2-3 mm çapında, pigmentsiz S koloniler oluşturur. (2)
2. ANALİZ VE DOĞRULAMA
2.1. Standarta Uygun Besiyeri Seçimi ve Değerlendirme
İçme ve kullanma sularında koliform grup analizi ile ilgili standart; TS EN ISO 9308-1 standardıdır. 2014 yılında yapılan revizyonla, bu analiz için kullanılacak besiyeri; “TTC agar with Tergitol 7” yerine “Chromogenic Coliform Agar (CCA)” olarak belirlenmiştir. Bu iki besiyeri arasındaki farklar özetle şu şekildedir;
Lactose TTC agar with Tergitol 7 besiyerinde tüm koliform bakteriler turuncu renkli koloni oluşturur. Bu koloniler arasında E. coli, ayırt edilemez. Sadece turuncu renkli koloni görülmesi yeterli değildir, laktoz pozitif (koliform grup bakteri) sonucun doğrulanması için filtre altında sarı benek görülmelidir. (1)
CCA, kromojenik bir besiyeri olduğu için zamanla renk değişmesi olmaz. Bu besiyerinde E. coli mavi/mor, diğer koliform grup bakteriler ise pembe/ kırmızı renkli koloniler oluştururlar.
CCA besiyerinde gelişen tüm koliform grup bakteriler, ß-D-galactosidase enzimleri ile pembemsi kırmızı koloni oluştururlar. Dolayısı ile E. coli kolonisi de aynı renktedir. Ancak E. coli, diğer koliform grup bakterilerde bulunmayan ß-D-glucuronidase enzimi aracılığı ile besiyeri bileşimindeki X-Glucuronide substratını da parçalayarak koloninin koyu mavi menekşe olmasını sağlar. (1)
CCA besiyerinin, selektivitesi düşük olduğu ve bu nedenle sadece düşük sayıda bakteri olması beklenen su numuneleri için uygun olduğu unutulmamalıdır. TS EN ISO 9308-1 numaralı standartta bu konu açıkça belirtilmektedir. (1)
Gıdaların, özellikle yoğun refakatçi flora varlığında koliform grup bakteriler ile E. coli aranması ve sayılmasında kullanılan chromocult coliform agar ES (enhanced selectivity) besiyeri ile suların analizinde kullanılan chromocult coliform agar’ın besiyeri bileşimi farklıdır. Chromocult coliform agar ES besiyeri, TS EN ISO 9308-1 numaralı standarda uygun olarak insani tüketim amaçlı sularda koliform grup ve E. coli analizinde kullanılmaz.
Kanalizasyon, atık su, yüzey suları ve sığ yüzey suları vb. gibi yoğun refakatçi flora bulunması beklenen su numunelerinde koliform grup bakteriler ile E. coli aranması/ sayılması gerekiyorsa standart chromocult coliform agar bu amaçla kullanılamaz. Bu tip sularda TS EN ISO 9308-2 olan bölümüne uygun olarak EMS yöntemi ile analiz yapmalıdırlar. (1)
CCA besiyeri ile ilgili olarak hiçbir şekilde gözden kaçırılmaması gereken bir diğer husus, 24 saatten daha uzun süren inkübasyon sonrasında tipik koliform grup bakteri ve/veya E. coli koloni morfolojisinde koloni gelişimi olursa bunların değerlendirmeye alınmaması gerektiğidir. Bir başka ifade ile besiyerinin düşük selektivitesi, refakatçi florayı ancak 24 saat baskılayabilir. Besiyeri bileşimindeki seçilmiş peptonlar, piruvat ve fosfat tampon, ağır hasar görmüş koliformların kendilerini onarmalarını sağlarken yegâne inhibitör Tergitol 7'dir. (1)
TS EN ISO 9308-1 numaralı standarda göre, CCA besiyerinde gelişen tipik kolonilere oksidaz testi uygulanması gereklidir.
CCA besiyeri bileşimindeki triptofan varlığına bağlı olarak, gelişen tipik koloniler üzerinde indol testi yapılabilir. İndol pozitif olan E. coli için bu test sadece doğrulama amaçlıdır, ancak E. coli biyotip 2'nin indol negatif olduğu unutulmamalıdır. Pembemsi kırmızı renkli kolonilerden indol pozitif sonuç veren çıkarsa analiz edilen numunede E. coli O157:H7 varlığından ciddi şekilde şüphe edilmelidir. (1)
2.2. En Muhtemel Sayı Yöntemi ile Analiz
Türk Standartları Enstitüsü (TSE) ve Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO)'nün koliform grup mikroorganizma aramak için kullanılan standart analiz yöntemlerine göre; örnek hazırlanıp dilüsyonları yapıldıktan sonra ardışık 5 dilüsyondan 3'er adet Lauril Sülfat Triptoz Broth (LST) besiyerine 1'er ml ekim yapılmakta (bkz. yandaki görsel) ve 37oC'de 24 (gerekirse 48) saat inkübasyondan sonra pozitif sonuç veren tüpler muhtemel koliform olarak değerlendirilmektedir. Bu yönteme göre, muhtemel koliformların sayısını doğrulamak için de Brilliant Green Bile Broth (BGBB) besiyerine ekim yapılmakta ve 37oC 'de 24 (gerekirse 48) saat inkübasyondan sonra pozitif sonuç veren tüpler koliform grup olarak doğrulanmaktadır. (3)
TS 6063/ISO 7251 'e göre E. coli aranmasında; analize koliform grupta olduğu gibi örneğin hazırlanıp dilüsyonlarının yapılmasından sonra, ardışık 5 dilüsyondan 3'er adet LST besiyerine 1'er ml ekim yapılmakta ve tüpler 37oC'de 24 (gerekirse 48) saat inkübasyona bırakılmaktadır. Burada pozitif sonuç veren tüplerden, su banyosunda 44,5oC 'de tutulan E. Coli (EC) Broth besiyerlerine ekim yapılmakta ve gaz oluşumu için yine 44,5oC 'de 24 (gerekirse 48) saat inkübe edilmektedir. Bu sürenin sonunda gaz oluşumu görülen tüplerfekal koliform olarak değerlendirilmektedir. Testin devamında EC Broth besiyerinde pozitif sonuç veren tüplerden 44,5oC'deki Tripton Water (TW) besiyerine ekim yapılmakta ve aynı derecede 48 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra indol testi yapılmaktadır. Bu testin sonunda indol pozitif tüpler E. coli, negatifler ise E. coli dışındaki diğer fekal koliformlar olarak değerlendirilmektedir.(3)
Amerikan Resmi Analitik Kimyacılar Birliği (Association of Official Analytical Chemist; AOAC) 'nin koliform grup/ E. coli aranması için önerdiği yöntem EMS yöntemidir. AOAC'ye göre örnek hazırlanıp dilüsyonları yapıldıktan sonra, ardışık 3 dilüsyondan 3'er adet LST besiyerine 1'er ml ekim yapılmakta, 35oC'de 48 saat süren inkübasyondan sonra pozitif sonuç veren tüpler muhtemel koliform grup olarak değerlendirilmektedir. İkinci aşamada pozitif sonuç veren bu tüplerden BGBB ve EC Broth besiyerlerine ekim yapılıp, 35oC'de 48 saat inkübe edildikten sonra, BGBB tüplerinden alınan pozitif sonuçlar koliform grup olarak doğrulanmakta, 44,5oC'de 48 saate kadar inkübe edilen EC Broth tüplerinden alınan pozitif sonuçlar ise fekal koliform olarak kabul edilmekte ve sayılmaktadır. Son olarak EC Broth besiyerinde gaz pozitif tüplerden Eosin Metilen Blue Agar (EMB) besiyerine sürme yapılarak, ayrıca gram boyama ve IMVEC testleri uygulanarak E. coli doğrulanmaktadır. (3)
Amerikan Halk Sağlığı Kuruluşu (American Public Health Association; APHA) tarafından özellikle suların mikrobiyolojik analizinde kullanılmak üzere önerilen Amerikan Standartları metoduna göre koliform grup/fekal koliform/E. coli aranmasında %0,5 Laktoz Broth (LB) kullanılmaktadır. Buna göre; her biri 20ml LB besiyeri içeren 15 adet tüpe, 5x10ml, 5x1ml ve 5x0,1ml olacak şekilde ekim yapılmakta ve tüpler 35oC'de 24-48 saat inkübasyona bırakılmaktadır. İnkübasyon sonunda gaz oluşturan tüpler muhtemel koliform olarak kabul edilmektedir. Daha sonra gaz oluşturan bu tüplerden EMB agara sürme yapılmakta ve 35oC'de 24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. Eğer bu besiyerinde tipik E.coli kolonileri oluşmuş ise tamamlama testi yapılmakta, oluşmamış ise teste son verilmektedir. Tamamlama testinde EMB agardan birkaç değişik koloni alınarak LB fermentasyon besiyerine ve yatık Nutrient Agar (NA) besiyerine ekim yapılarak her iki besiyeri de 35oC'de 24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. İnkübasyon sonunda LB besiyerinde gaz oluşmuş ve NA'dan alınan kolonilerde gram(-) sporsuz çubuk bakteriler tespit edilmişse su örneğinde koliform bakteri olduğu kabul edilir. Aynı kuruluş fekal koliform testi için EC Broth besiyerinde 44±0,2oC'de 48 saat inkübasyonda gaz oluşumu görülen tüplerin fekal koliform olarak değerlendirilmesini önermektedir. (3)
2.3. Katı Besiyeri Yöntemi ile Analiz
Koliform grup ve E.coli aranmasında genel olarak EMS yöntemi gösterilmesine karşın; özellikle izolasyon gerektiren analizlerde katı besiyerlerine ekim yöntemi kullanılır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan besiyeri Violet Bile Red (VRB) Agar’dır.
VRB Agar besiyerine alternatif olarak Petrifilm VRB yöntemi de kullanılabilmektedir. Bu yönteme göre VRB Laktoz Agar besiyeri kullanılması önerilmektedir. Besiyeri bileşiminde katılaştırıcı ajan olarak agar yerine soğuk suda çözülebilen bir madde kullanılmaktadır. Bileşenler kurutularak üzeri plastik film ile kaplanmış halde kullanıma hazır olarak satılmaktadır. Yönteme göre seyreltiden veya direkt örnekten 1 ml alınarak besiyeri üzerine ilave edilir. Plastik film üzerine basınç uygulanarak örneğin 20 cm2 alana yayılması sağlanır. 32±1 oC 'da 24±2 saat inkübasyondan sonra, etrafında bir veya daha fazla gaz kabarcığı görünen koloniler koliform olarak sayılır. Burada ister koliform olsun ister başka bir tür kolonilerin kırmızı renkli olacağı unutulmamalıdır. (3)
E. coli sayımında katı besiyeri olarak Triptik Soy Agar (TSA) besiyeri de kullanılmaktadır. Dökme plak yöntemi ile hazırlanan petri kutuları 35oC 'de 2 saat inkübasyondan sonra besiyerinin üzeri ikinci tabaka olarak VRB Agar ile kaplanmakta ve inkübasyona 44,5oC 'de 24 saat devam edilmektedir. Bu yöntemle, hasar görmüş E. coli hücrelerinin sayımında daha iyi sonuçlar alınmaktadır. (3)
2.4. Membran Filtrasyon Yöntemi (HGMF Tekniği) ile Analiz
Hidrofobik Grid Membran Filitre (HGMF) tekniği, özellikle su ve diğer sıvı gıdaların analizinde kullanılmaktadır. Bu teknikte örnek önce bir membran filitreden geçirilerek mikroorganizmalar filitre üzerinde tutulmaktadır. Daha sonra bu filitreler uygun bir besiyeri üzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilmekte ve oluşan koloni sayısından materyaldeki mikroorganizma sayısı hesaplanmaktadır. Filitreler üzerinde bulunan birbirini dik kesen hidrofobik hatlar, oluşan kolonilerin dağılmasını önlemekte ve böylece sayım yapılmasını kolaylaştırmaktadır. HGMF tekniği ile E. coli sayımı AOAC tarafından standart analiz yöntemi olarak kabul edilmiştir. (3)
Membran filitrasyon tekniğinin bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bunlardan en önemlileri; örnekte az sayıda mikroorganizmanın bulunması durumunda bile belirleme imkanı vermesi ve inkübasyondan sonra filitrelerin kurutularak saklanabilmesidir. (3)
HGMF ile fekal koliform sayılmasında filitre, TSA besiyerine yerleştirilmekte ve kuru gıdalar için 25oC 'de 4-5 saat, diğer gıdalar için 35oC'da 4-5 saat olmak üzere, hasar görmüş ve stres altındaki mikroorganizmaların tekrar aktivite kazanmalarını sağlamak amacı ile bir ön inkübasyon uygulanmaktadır. Filitreler buradan m-FC Agar besiyerine alınmakta ve 44,5oC'da 24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. İnkübasyon sonunda bir veya daha çok mavi renkli koloni gelişimi görülen alanlar belirlenmekte ve değerlendirme koliform sayımında olduğu gibi yapılmaktadır. (3)
Öneki konuda da belirtildiği üzere; İçme ve kullanma sularında koliform grup analizi ile ilgili stadart; TS EN ISO 9308-1 standartıdır ve bu analiz için kullanılacak olan besiyeri “Chromogenic Coliform Agar (CCA)” olarak belirlenmiştir.
CCA Agar’da; Koliformlar, β-galaktosidaz (β-gal) üretimi ile ayırt edilir. Bu enzim kromojenik substrat ile reaksiyona girer ve pembe – kırmızı (somon kırmızısı) bir renk oluşmasını sağlar.
E. coli bakterisi ise β-glukuronidaz enzimi sayesinde kromojenik substrat ile girdiği reaksiyonda mavi-mor renk koloniler oluşturur.
Toplam Koliform; somon kırmızısı koloniler (koliform) ile mavi-mor (E.coli) kolonilerinin toplamıdır.
Membran filtrasyon yöntemin’de özellikle içecek numunelerinde, örneklerin süzülmesi zaman zaman sorun olabilmektedir. Numune su gibi saf olmadığı için, hızlıca filtrenin tıkanmasına neden olabilir ve süzme işlemi tamamlanamayabilir. Bunun yanında, filte üzerindeki birikinti nedeniyle sonuçların okunması ve kolonilerin sayılması zor olabilir. Buna bir çözüm olarak çift aşamalı süzme düzeneği kullanılabilir. Bunun için; mevcut Membran filtre düzeneğiyle uyumlu bir Prefiltre ataçmanı temin edilmelidir. Bu prefiltre ataçmanına numuneye göre 5 – 10 μ’luk selüloz nitrat filtre takılır. Numune önce üst haznedeki prefiltre kısmında süzülür, askıdaki materyal burada birikir ve daha berraklaşmış olan sıvı alt haznedeki 0.45μ mikrobiyal filtrede süzülmüş olur.
Bu ön filtrasyon ataçmanı’nın maliyeti ise Sartorius 16807 için yaklaşık 350 – 400 Euro/adet civarındadır.
2.5. Koliform ve E.coli İdentifikasyonu
IMVEC Testleri: Uluslararası standartda E. coli'nin doğrulaması için IMVEC testleri gösterilmektedir.
I: İndol testi M: Metil red testi V: Voges-Proskauer testi E: Eijkman testi veya 44,5±0,2 oC'de gelişme testi, C: Sitrat testi
HOMoC testleri: H: Hidrojen sülfür (H2S) oluşum testi, O: Ornitin dekarboksilaz testi, Mo: Hareketlilik testi, C: Sitrat testi
Ayrıca; glikozdan gaz oluşumu, laktoz, mannit, sorbitol fermentasyon testleri, lisin dekarboksilasyonu, indol ve oksidaz testleri koliform grup bakterilerin identifikasyonu için önerilen diğer bazı testlerdir.
Oksidaz testi: Koliform şüpheli kolonileri, Laktoz fermentasyonu yaparak benzer morfooloji gösteren Oksidaz pozitif (ör; Aeromonas spp.) kolonileri ayırd etmek için Oksidaz testi yapılır. Koliformlar Oksidaz negatiftir. Oksidaz testi saf koloniye yapılmalıdır. Bu amaçla, şüpheli koloniler seçici olmayan agar’da 36±2 ºC’de 21±3 saat süreyle inkübe edilmeli ve oksidaz deneyi aşağıdaki şekilde uygulanmalıdır:
- İki üç damla taze hazırlanmış oksidaz reaktifi bir süzgeç kağıdı üzerine damlatılır.
- Cam çubuk, tahta çubuk, plâstik veya plâtin (nikel krom olmayan) tel öze ile koloninin bir kısmı hazırlanan süzgeç kağıdı üzerine sürülür.
- 30 saniye içerisinde koyu mavi – mor rengin ortaya çıktığının görülmesi, pozitif reaksiyon olarak kabul edilir.
- Oksidaz negatif reaksiyon veren koloniler Kolfirom grup olarak kabul edilir.
İndol testi: Indol testi saf koloniye yapılmalıdır. Bu amaçla, şüpheli koloniler seçici olmayan agar’da 36±2 ºC’de 21±3 saat süreyle inkübe edilmeli ve İndol deneyi aşağıdaki şekilde uygulanmalıdır:
- Triptofan Water (veya Fluorocult LST broth) sıvı besiyerine şüpheli koloni inoküle edilir ve 44,0±0,5ºC’da 21±3 saat inkübe edilir.
- LST broth içindeki küçük durham tüpünde gaz oluşumu gözlenen örneklere; 0,2 ml - 0,3 ml Kovacs reaktifi ilâve edilir ve indol üretimi incelenir.
- Sıvı besiyeri yüzeyinde kiraz kırmızısı bir halkanın oluşması indol üretimini doğrular.
- Oksidaz negatif ve indol pozitif reaksiyon veren koloniler E.coli olarak sayılır.
UV Labma testi: UV ışıma testi de yine saf koloniye yapılmalıdır. Bu amaçla, İndol testi i çin ekim yapılan LST broth tüpleri, kovacs reaktifi damlatılmadan evvel UV ışıma testine tabii tutulabilir. Böylece UV testi için ayrıca ekim yapmak gerekmez.
Loş bir ortamda gaz pozitif tüplere UV lamba (ör: Merck 113203 Uv Lambası 4W/366Nm) tutulduğunda floresan ışıma veren tüplerdeki örneklerde E.coli varlığı doğrulanmış olur.
YARARLANILAN KAYNAKLAR
(1) HALKMAN A. Kadir, Gıda Mikrobiyolojisi, 2019. Editör: A. Kadir Halkman. Başak Matbaacılık ve Tanıtım Hizmetleri Ltd, 648 s. ISBN: 978-605-245-683-5, Ankara.
(2) TAŞDEMİR Cihan, 2009. Toplum ve Hastane Kaynaklı İnfeksiyonlardan İzole Edilen E.coli Suşlarının Antimikrobiyal Direnç Fenotiplerinin Araştırılması, Haydarpaşa Numune Eğ. ve Ar. Hastanesi, İstanbul.
(3) Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, Ankara Ünv. Ziraat Fak. Gıda Müh. Bölümü
(4) https://freshproducetool.foodstandards.gov.scot/node/21023
(5) TS EN ISO 9308-2, Su kalitesi - Escherichia coli ve koliform bakteri sayımı - Bölüm 2: En muhtemel sayı yöntemi
(6) TS EN ISO 9308-3, Su kalitesi-Yüzey ve atık sularda escherichia coli ve koliform bakterilerin tespit edilme ve sayımı-Bölüm 3:Sıvı ortamlarda aşılama ile küçültme metodu (en muhtemel sayı)