Su ve İçecek Mikrobiyolojisi
Su ve İçecek üretimlerinde Pseudomonas aeruginosa analizi
Ersin YILDIZ / 07-2021 - rev1 www.beverageandwater.org ersin.yildiz@outlook.com
1. GİRİŞ
Pseudomonadaceae familyasına bağlı Pseudomonas cinsi bakteriler gram negatif çomaklardır.
Bu cinsin türlerinin bazıları oksidaz pozitif, bazıları oksidaz negatiftir. Türlerin tamamı katalaz (+), aerobik, polar flagellası ile hareket edebilen bakterilerdir. Bazı türleri insan, hayvan ve bitki patojenidir.(1) Bu cinsin türleri glikozu oksidasyon yoluyla parçalayan fakat fermantasyon yapmayan bakterilerdir.(2)
Pseudomonas'ları gıdalar için önemli kılan pek çok özelliğe sahiptirler. Bazı türleri proteolitik ve lipolitik aktivite göstermektedir. Aerobik olmaları nedeniyle gıdaların yüzeyinde hızla gelişebilmeleri sonucu okside ürünler ve mukoz madde oluştururlar. Kendi gelişmeleri için gerekli gelişme faktörleri ve vitaminleri sentezleme yeteneğindedirler.(2) Psikrofil, mezofil veya psikrotrof türleri vardır. Özellikle soğukta saklanan et, tavuk eti, yumurta ve deniz ürünlerinin birinci derecede bozulma etmenidirler. Bazı gıda maddeleri üzerinde Pseudomonas fluorescens yeşilimsi, P. nigrificans siyah, diğer türleri ise kahverengi pigment oluştururlar. (1) Isı ve radyasyonla kolayca öldürülürler, oksijen olmadığı zaman ve 42oC 'nin üzerinde üreyemezler ve kurumaya dirençleri zayıftır.
Pseudomonasa aeruginosa; 0,5-0,8 µm eninde, 1,5-3 µm boyunda olabilen basil veya kokobasil morfolojisinde bakterilerdir. Spor oluşturmazlar. Gram negatif olarak boyanır. Tek polar flagellası ile hareketlidir.(7) Genellikle kapsülsüz mikroorganizmadır. Zorunlu aerobtur, ancak oksijen yokluğunda da ortamda elektron alıcı olarak yeterli NO3 varsa yaşamını devam ettirebilir. En iyi 37°C’de olmakla beraber, 20- 42°C arasındaki ısılarda üreyebilir. Tek karbon kaynağı olarak çok fazla sayıda substratı kullanabilmesi sayesinde birçok besiyerinde üreyebilir. Organik üreme faktörlerine gereksinimleri yoktur. Tek bir karbon kaynağı varlığında üreyebilen nadir bakterilerdendir.(7)
Bu organizma genellikle göller ve nehirler gibi doğal sularda bulunur. P. aeruginosa deiyonize veya damıtılmış suda da yaşayabilir. Bununla birlikte içme suyunda buunması beklenmez. İçme suyunda meydana gelmesi, muhtemelen proseste (borular-boru sistemlerindeki kör noktalar, vanalar vb. yerlerde) biyofilm yapma yeteneği ile ilgilidir. Pseudomonas aeruginosa, biyofilm oluşturmada özellikle iyi olan bir bakteri türüdür. İçme suyunda büyümesi, çok sayıda bulunması halinde renk, tat, koku ve bulanıklık sorunlarına neden olabilir. Bir kez kurulduktan sonra, biyofilmlerin insan yapımı su sistemlerinden yok edilmesi zor olabilir, çünkü bir biyo-dağıtıcıya (biyofilmi parçalayacak bir kimyasal) ve/veya dezenfeksiyondan önce fiziksel olarak uzaklaştırmaya ihtiyaçları vardır.(9)(10)
Kültürlerde bazen ikişerli, ancak çoğunlukla tek tek görülen ince düz, çomaklardır. P. aeruginosa genel besiyerlerinde kolaylıkla ürer. %5 koyun kanlı agarda beta hemoliz oluşturur. 37oC ‘de 24 saat sonra iki tip koloni oluşturur. Birinci tip koloniler büyük, düzgün, parlak, nemli ve yaygındır. İkinci tip koloniler daha çok doğal kaynaklardan izole edilen suşlardan meydana gelir. Bunlar küçük, konveks ve düzensiz şekildedir.(3)
Kanlı basiyerinde 1-5 mm çapında, yassı, buzlu cam görünümünde, kenarları ondülan yapıda koloniler oluşturur. Genellikle β hemoliz oluştururlar. Eozin Metilen Blue (EMB), McConkey agar gibi laktoz içeren besiyerlerinde laktoz negatif koloni yaparlar. Besiyerlerinde kendisine özgü bir kokusu vardır. Tatlımsı aromatik meyve, tatlı üzüm – menekşe ya da trimetilamin kokusuna benzeyen özel koku, 2- aminoasetofenon’a aittir ve P. aeruginosa’ya özgüdür.(7)
Karbonhidratları fermente etmez ama glukoz, fruktoz ve ksilozdan oksidatif metabolizma ile asit oluşturur, laktoz ve sükrozdan asit oluşturmaz. Oksidaz testi güçlü pozitiftir. Nitrat ve nitriti denitrifiye ederek nitrojen gazı oluşturur, Simmon’s sitrat besiyerinde üreyerek pozitif reaksiyon verir. Jelatin, Üreaz ve L-arjinin dehidrolaz testi pozitiftir. H2S, L-lizin dekarboksilaz, Indol, MR, VP ve Lornitin dekarboksilaz testleri negatiftir. Düşük pH (<4,5) değerinde üreyemez.(3) (7) Katalaz testi pozitiftir. TSI agarda alkali reaksiyon verir, gaz oluşturmaz. Bakteriosin üretir (Pyosin). Litik fajları vardır. Ekzotoksinleri mevcuttur.(3)
P. aeruginosa normal hava koşullarında, sularda aylarca canlı kalabilir. Oda sıcaklığında steril saf su içinde bile üreyebilirler. Kimyasal dezenfektanlara karşı oldukça dirençlidirler.(5) Pseudomonasa aureginosa saprofit bir tür olmakla birlikte gastroenterik hastalıklara neden olabilir. (1) Toprak ve suda yaygın olarak bulunur.
P. aeruginosa nemli ortamı sever. İnsanda perine, koltuk altı, kulak gibi nemli bölgelere yerleşir. Solunum cihazları temizlik solüsyonları, ilaçlar dezenfektanlar, küvetler, paspaslar yerleşim yerleridir. Bulaş yüzme havuzu, jakuzi, sauna, kontak lens solüsyonları gibi hastane dışında su ile ilgili kaynaklardan da olabilir.(7)
2. ANALİZ ve DOĞRULAMA
2.1. Standarta Uygun Besiyeri Seçimi ve Değerlendirme
İçme ve kullanma sularında Pseudomonas aeruginosa analizi ile ilgili standart; TS EN ISO 16266 standardıdır. Bu analiz için kullanılan besiyeri Pseudomonas CN Agar’dır. CN agar, P. aeruginosa dışındaki bakterilerin büyümesini engelleyecek konsantrasyonlarda setil trimetilamonyum bromür ve nalidiksik asit içerir.
CN katkılı Pseudomonas agar besiyeri aerobik ortamda 36 ±2oC 'ta 44 ±4 saat inkübe edilir. Membran filtreler 20 ±2 saat inkübasyondan sonra koloni gelişmesi açısından kontrol edilir. İnkübasyondan sonra pyocyanin oluşumuna bağlı olarak mavi-yeşil renkli koloniler Pseudomonas aeruginosa olarak sayılır. Bunların dışında uzun dalga UV lamba altında floresan ışıma veren ve/veya kırmızımsı kahverengi koloniler muhtemel Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilir ve bunlar King agar ve/veya asetamit broth ile doğrulanır.(4)
Özellikle suların analizinde Pseudomonas fluorescens sıklıkla Pseudomonas aeruginosa’ya benzeri koloni oluşturur. King agar ve/veya asetamit broth testleri ile bu 2 bakteri kolaylıkla ayırt edilebilir. (4)
Asetamit broth testinde Pseudomonas aeruginosa pozitif, Pseudomonas fluorescens negatif sonuç verir. Daha basit bir test ise 42oC 'ta gelişme testidir. CASO broth gibi genel bir sıvı besiyerinde 24 saat inkübasyon sonunda gelişme olursa izolat Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilir. Pseudomonas fluorescens 42oC 'ta gelişemez.(4)
2.2. Membran Filtrasyon Yöntemi (HGMF Tekniği) ile Analiz
Hidrofobik Grid Membran Filitre (HGMF) tekniği, özellikle su ve diğer sıvı gıdaların analizinde kullanılmaktadır. Bu teknikte örnek önce bir membran filitreden geçirilerek mikroorganizmalar filitre üzerinde tutulmaktadır. Daha sonra bu filitreler uygun bir besiyeri üzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilmekte ve oluşan koloni sayısından materyaldeki mikroorganizma sayısı hesaplanmaktadır. Filitreler üzerinde bulunan birbirini dik kesen hidrofobik hatlar, oluşan kolonilerin dağılmasını önlemekte ve böylece sayım yapılmasını kolaylaştırmaktadır.(6)
Membran filitrasyon tekniğinin bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bunlardan en önemlileri; örnekte az sayıda mikroorganizmanın bulunması durumunda bile belirleme imkanı vermesi ve inkübasyondan sonra filitrelerin kurutularak saklanabilmesidir. (6)
Membran filtrasyon yöntemin’de özellikle içecek numunelerinde, örneklerin süzülmesi zaman zaman sorun olabilmektedir. Numune su gibi saf olmadığı için, hızlıca filtrenin tıkanmasına neden olabilir ve süzme işlemi tamamlanamayabilir. Bunun yanında, filte üzerindeki birikinti nedeniyle sonuçların okunması ve kolonilerin sayılması zor olabilir. Buna bir çözüm olarak çift aşamalı süzme düzeneği kullanılabilir. Bunun için; mevcut Membran filtre düzeneğiyle uyumlu bir Prefiltre ataçmanı temin edilmelidir. Bu prefiltre ataçmanına numuneye göre 5 – 10 μ’luk selüloz nitrat filtre takılır. Numune önce üst haznedeki prefiltre kısmında süzülür, askıdaki materyal burada birikir ve daha berraklaşmış olan sıvı alt haznedeki 0.45μ mikrobiyal filtrede süzülmüş olur.
Bu ön filtrasyon ataçmanı’nın maliyeti ise Sartorius 16807 için yaklaşık 350 – 400 Euro/adet civarındadır.
2.3. Psudomonas aeruginosa İdentifikasyonu
Esasında membran üzerinde açıkça piyosiyanin (yeşil/mavi pigmentli) üreten koloniler, P. aeruginosa olarak kabul edilir ve daha fazla test gerektirmez. Floresan veya kırmızı/ kahverengi olan diğer koloniler için doğrulama gerekir.
Asetamit testi: Sitrat testinde olduğu gibi, bu besiyeri bileşiminde tek karbon kaynağı asetamittir. Pseudomonas aeruginosa ile Pseudomonas fluorescens ayrımında kullanılır. Başta içme ve kullanma suyu olmak üzere çeşitli gıda numunelerinin analizlerinde bu iki bakteri birbirine çok benzer koloni oluşturur.
Testin uygulanışında; yaklaşık 18 saatlik aktif ve saf kültür ile aşılanan besiyeri 37°C'ta 18-48 saat inkübe edilir. Besiyerinin pembe renkten menekşe-kırmızı renge dönüşümü asetamit pozitif, orijinal pembe renkte kalması asetamit negatif olarak değerlendirilir. Asetamit testinde pozitif şahit olarak Pseudomonas aeruginosa, negatif şahit olarak Pseudomonas fluorescens kullanılabilir.(4)
Pseudomonas aeruginosa pozitif, Pseudomonas fluorescens negatif sonuç verir.
Asetamit Broth Besiyeri
Bileşimi; 10g acetamide , 5g NaCl , 1.39g K2HPO4 , 0.73g KH2PO4 , 0.5g MgSO4 , 0.012g phenol red ve 1L saf su şeklindedir. Bileşenler, gerekirse hafifçe ısıtılarak saf suda çözülür. Kimi kaynaklar 121 oC'ta 15 dk sterilize edileceğini belirtirken kimi kaynaklar besiyerinin fazla ısıtılmasından kaçınılması gerektiğini ve sterilizasyon için membran filtre kullanılmasını önermektedirler. Besiyeri bileşimindeki asetamit zehirlidir, solunmasından sakınılmalıdır. Çeker ocak içinde çalışılmalıdır.(4)42oC'ta gelişme testi: 2.2. başlığı altında da belirtildiği gibi;
CASO broth gibi genel bir sıvı besiyerinde 24 saat inkübasyon sonunda gelişme olursa izolat Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilir. Pseudomonas fluorescens 42oC 'ta gelişemez. (4)
MCA (Milk Agar wtih Cetrimide)’a ekim: P.aeruginosa doğrulaması için kullanılabilen bir başka metod da MCA’ya pasaj yöntemidir. Bu test şu şekilde uygulanır;
Doğrulanmak istenen kolonilerden MCA’ya ekim yapılır ve 37°C'de 22 ± 4 saat inkübe edilir.
Plakalar; büyüme, pigment, floresan ve kazein hidrolizi (kolonilerin etrafındaki zonun opaklığı) açısından incelenir.
Pigment üretimi zayıfsa, pigment üretimini artırmak ve yeniden incelemek için petriler; oda sıcaklığında 2-4 saat gün ışığına maruz bırakılır.
P. aeruginosa oksidaz pozitiftir, kazeini hidrolize eder ve piyosiyanin ve/veya floresan üretir. Nadiren P. aeruginosa'nın atipik pigmentsiz varyantları ortaya çıkar. Bu nedenle Piyosiyanin negatif ama kazein hidrolizi ve floresan pozitif kültürler P. aeruginosa olarak kabul edilmelidir.
YARARLANILAN KAYNAKLAR
(1) ARICI Muhammet, Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, Yıldız Teknik Ünv. İstanbul.
(2) ÜZÜMCÜ Zuhal, ARIKAN Burhan, 2010. Pseudomonas sp. Suşlarında Cold Shock Protein İzolasyonu ve Sds-Page Analizi, Ç.Ü. Fen Bil. Ens.
(4) HALKMAN A. Kadir, Gıda Mikrobiyolojisi, 2019. Editör: A. Kadir Halkman. Başak Matbaacılık ve Tanıtım Hizmetleri Ltd, 648 s. ISBN: 978-605-245-683-5, Ankara.
(5) https://www.laboratuvar.net/gida-analizleri/mikrobiyolojik-analizler/pseudomonas-aeruginosa-tayini/
(6) Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, Ankara Ünv. Ziraat Fak. Gıda Müh. Bölümü
(7) KALIN Ramadan Bilgin 2014. Bazı Boronik Asit Türevlerinin Pseudomonas aeruginosa’da Virülens Faktörlerinin Üretimine Etkisinin Araştırılması, SDÜ, Fen Bil. Ens. Biyoloji Anabilim Dalı, Isparta.
(10) Health Technical Memorandum 04-01 Addendum: Pseudomonas aeruginosa – advice for augmented care units