Pseudomonas aeruginosa Analizi

Su ve İçecek Mikrobiyolojisi

202107-Pseudomonas-aeruginosa-Analizi

.pdf

Download PDF • 1.23MB

Su ve İçecek üretimlerinde Pseudomonas aeruginosa analizi

Ersin YILDIZ / 07-2021 - rev1 www.beverageandwater.org ersin.yildiz@outlook.com

1. GİRİŞ

Pseudomonadaceae familyasına bağlı Pseudomonas cinsi bakteriler gram negatif çomaklardır.

Bu cinsin türlerinin bazıları oksidaz pozitif, bazıları oksidaz negatiftir. Türlerin tamamı katalaz (+), aerobik, polar flagellası ile hareket edebilen bakterilerdir. Bazı türleri insan, hayvan ve bitki patojenidir.(1) Bu cinsin türleri glikozu oksidasyon yoluyla parçalayan fakat fermantasyon yapmayan bakterilerdir.(2)

Pseudomonas'ları gıdalar için önemli kılan pek çok özelliğe sahiptirler. Bazı türleri proteolitik ve lipolitik aktivite göstermektedir. Aerobik olmaları nedeniyle gıdaların yüzeyinde hızla gelişebilmeleri sonucu okside ürünler ve mukoz madde oluştururlar. Kendi gelişmeleri için gerekli gelişme faktörleri ve vitaminleri sentezleme yeteneğindedirler.(2) Psikrofil, mezofil veya psikrotrof türleri vardır. Özellikle soğukta saklanan et, tavuk eti, yumurta ve deniz ürünlerinin birinci derecede bozulma etmenidirler. Bazı gıda maddeleri üzerinde Pseudomonas fluorescens yeşilimsi, P. nigrificans siyah, diğer türleri ise kahverengi pigment oluştururlar. (1) Isı ve radyasyonla kolayca öldürülürler, oksijen olmadığı zaman ve 42oC 'nin üzerinde üreyemezler ve kurumaya dirençleri zayıftır.

Pseudomonasa aeruginosa; 0,5-0,8 µm eninde, 1,5-3 µm boyunda olabilen basil veya kokobasil morfolojisinde bakterilerdir. Spor oluşturmazlar. Gram negatif olarak boyanır. Tek polar flagellası ile hareketlidir.(7) Genellikle kapsülsüz mikroorganizmadır. Zorunlu aerobtur, ancak oksijen yokluğunda da ortamda elektron alıcı olarak yeterli NO3 varsa yaşamını devam ettirebilir. En iyi 37°C’de olmakla beraber, 20- 42°C arasındaki ısılarda üreyebilir. Tek karbon kaynağı olarak çok fazla sayıda substratı kullanabilmesi sayesinde birçok besiyerinde üreyebilir. Organik üreme faktörlerine gereksinimleri yoktur. Tek bir karbon kaynağı varlığında üreyebilen nadir bakterilerdendir.(7)

Bu organizma genellikle göller ve nehirler gibi doğal sularda bulunur. P. aeruginosa deiyonize veya damıtılmış suda da yaşayabilir. Bununla birlikte içme suyunda buunması beklenmez. İçme suyunda meydana gelmesi, muhtemelen proseste (borular-boru sistemlerindeki kör noktalar, vanalar vb. yerlerde) biyofilm yapma yeteneği ile ilgilidir. Pseudomonas aeruginosa, biyofilm oluşturmada özellikle iyi olan bir bakteri türüdür. İçme suyunda büyümesi, çok sayıda bulunması halinde renk, tat, koku ve bulanıklık sorunlarına neden olabilir. Bir kez kurulduktan sonra, biyofilmlerin insan yapımı su sistemlerinden yok edilmesi zor olabilir, çünkü bir biyo-dağıtıcıya (biyofilmi parçalayacak bir kimyasal) ve/veya dezenfeksiyondan önce fiziksel olarak uzaklaştırmaya ihtiyaçları vardır.(9)(10)

Kültürlerde bazen ikişerli, ancak çoğunlukla tek tek görülen ince düz, çomaklardır. P. aeruginosa genel besiyerlerinde kolaylıkla ürer. %5 koyun kanlı agarda beta hemoliz oluşturur. 37oC ‘de 24 saat sonra iki tip koloni oluşturur. Birinci tip koloniler büyük, düzgün, parlak, nemli ve yaygındır. İkinci tip koloniler daha çok doğal kaynaklardan izole edilen suşlardan meydana gelir. Bunlar küçük, konveks ve düzensiz şekildedir.(3)

Kanlı basiyerinde 1-5 mm çapında, yassı, buzlu cam görünümünde, kenarları ondülan yapıda koloniler oluşturur. Genellikle β hemoliz oluştururlar. Eozin Metilen Blue (EMB), McConkey agar gibi laktoz içeren besiyerlerinde laktoz negatif koloni yaparlar. Besiyerlerinde kendisine özgü bir kokusu vardır. Tatlımsı aromatik meyve, tatlı üzüm – menekşe ya da trimetilamin kokusuna benzeyen özel koku, 2- aminoasetofenon’a aittir ve P. aeruginosa’ya özgüdür.(7)

Karbonhidratları fermente etmez ama glukoz, fruktoz ve ksilozdan oksidatif metabolizma ile asit oluşturur, laktoz ve sükrozdan asit oluşturmaz. Oksidaz testi güçlü pozitiftir. Nitrat ve nitriti denitrifiye ederek nitrojen gazı oluşturur, Simmon’s sitrat besiyerinde üreyerek pozitif reaksiyon verir. Jelatin, Üreaz ve L-arjinin dehidrolaz testi pozitiftir. H2S, L-lizin dekarboksilaz, Indol, MR, VP ve Lornitin dekarboksilaz testleri negatiftir. Düşük pH (<4,5) değerinde üreyemez.(3) (7) Katalaz testi pozitiftir. TSI agarda alkali reaksiyon verir, gaz oluşturmaz. Bakteriosin üretir (Pyosin). Litik fajları vardır. Ekzotoksinleri mevcuttur.(3)

P. aeruginosa normal hava koşullarında, sularda aylarca canlı kalabilir. Oda sıcaklığında steril saf su içinde bile üreyebilirler. Kimyasal dezenfektanlara karşı oldukça dirençlidirler.(5) Pseudomonasa aureginosa saprofit bir tür olmakla birlikte gastroenterik hastalıklara neden olabilir. (1) Toprak ve suda yaygın olarak bulunur.

P. aeruginosa nemli ortamı sever. İnsanda perine, koltuk altı, kulak gibi nemli bölgelere yerleşir. Solunum cihazları temizlik solüsyonları, ilaçlar dezenfektanlar, küvetler, paspaslar yerleşim yerleridir. Bulaş yüzme havuzu, jakuzi, sauna, kontak lens solüsyonları gibi hastane dışında su ile ilgili kaynaklardan da olabilir.(7)

2. ANALİZ ve DOĞRULAMA

2.1. Standarta Uygun Besiyeri Seçimi ve Değerlendirme

İçme ve kullanma sularında Pseudomonas aeruginosa analizi ile ilgili standart; TS EN ISO 16266 standardıdır. Bu analiz için kullanılan besiyeri Pseudomonas CN Agar’dır. CN agar, P. aeruginosa dışındaki bakterilerin büyümesini engelleyecek konsantrasyonlarda setil trimetilamonyum bromür ve nalidiksik asit içerir.

CN katkılı Pseudomonas agar besiyeri aerobik ortamda 36 ±2oC 'ta 44 ±4 saat inkübe edilir. Membran filtreler 20 ±2 saat inkübasyondan sonra koloni gelişmesi açısından kontrol edilir. İnkübasyondan sonra pyocyanin oluşumuna bağlı olarak mavi-yeşil renkli koloniler Pseudomonas aeruginosa olarak sayılır. Bunların dışında uzun dalga UV lamba altında floresan ışıma veren ve/veya kırmızımsı kahverengi koloniler muhtemel Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilir ve bunlar King agar ve/veya asetamit broth ile doğrulanır.(4)

Özellikle suların analizinde Pseudomonas fluorescens sıklıkla Pseudomonas aeruginosa’ya benzeri koloni oluşturur. King agar ve/veya asetamit broth testleri ile bu 2 bakteri kolaylıkla ayırt edilebilir. (4)

Asetamit broth testinde Pseudomonas aeruginosa pozitif, Pseudomonas fluorescens negatif sonuç verir. Daha basit bir test ise 42oC 'ta gelişme testidir. CASO broth gibi genel bir sıvı besiyerinde 24 saat inkübasyon sonunda gelişme olursa izolat Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilir. Pseudomonas fluorescens 42oC 'ta gelişemez.(4)

2.2. Membran Filtrasyon Yöntemi (HGMF Tekniği) ile Analiz

Hidrofobik Grid Membran Filitre (HGMF) tekniği, özellikle su ve diğer sıvı gıdaların analizinde kullanılmaktadır. Bu teknikte örnek önce bir membran filitreden geçirilerek mikroorganizmalar filitre üzerinde tutulmaktadır. Daha sonra bu filitreler uygun bir besiyeri üzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilmekte ve oluşan koloni sayısından materyaldeki mikroorganizma sayısı hesaplanmaktadır. Filitreler üzerinde bulunan birbirini dik kesen hidrofobik hatlar, oluşan kolonilerin dağılmasını önlemekte ve böylece sayım yapılmasını kolaylaştırmaktadır.(6)

Membran filitrasyon tekniğinin bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bunlardan en önemlileri; örnekte az sayıda mikroorganizmanın bulunması durumunda bile belirleme imkanı vermesi ve inkübasyondan sonra filitrelerin kurutularak saklanabilmesidir. (6)

Membran   filtrasyon yöntemin’de özellikle içecek   numunelerinde, örneklerin süzülmesi zaman zaman sorun olabilmektedir.   Numune su gibi saf olmadığı için, hızlıca filtrenin tıkanmasına neden   olabilir ve süzme işlemi tamamlanamayabilir. Bunun yanında, filte üzerindeki   birikinti nedeniyle sonuçların okunması ve kolonilerin sayılması zor   olabilir. Buna bir çözüm olarak çift   aşamalı süzme düzeneği   kullanılabilir. Bunun için; mevcut Membran filtre düzeneğiyle uyumlu bir Prefiltre ataçmanı temin edilmelidir.   Bu prefiltre ataçmanına numuneye göre 5 –