Su ve İçecek Mikrobiyolojisi
Su ve içecek üretimlerinde Toplam Aerobik Koloni Sayımı
Ersin YILDIZ / 07-2021 – rev1
ersin.yildiz@outlook.com
1. GİRİŞ
Standart tanımıyla plate count agar (PCA) besiyerinde, aerobik ve mezofil inkübasyon koşullarında 72 saat sonunda oluşan tüm kolonilerin sayısı toplam aerobik koloni olarak ifade edilir. (1)
Toplam aerobik koloni sayımında yayma kültürel ekim yöntemi kullanılması önerilir. Bununla birlikte çeşitli ulusal ve uluslararası standartlarda toplam aerobik koloni sayımı için dökme kültürel sayım yöntemi de gösterilmektedir. Toplam aerobik koloni sayımında dökme kültürel sayım uygulamasından 2 nedenle sakınılmalıdır:
40 - 45 oC'ta yapılan dökme sırasında ısıya çok duyarlı bakteriler hasar görebilir. Bunun önüne geçmek için besiyeri 38 - 42 oC'ta dökülebilir, ancak yoğun ekimlerde erlendeki agarlı besiyerinin jelleşme potansiyeli vardır.
Pseudomonas spp. gibi zorunlu (obligat) aeroplar, petri kutusunun tabana yakın kısmında kalırlarsa kolaylıkla koloni oluşturamayabilirler. Bunun önüne geçmek için agarlı besiyeri 10-12 mL gibi düşük hacimde dökülebilir. (1)
2. ANALİZ ve DOĞRULAMA
2.1. Standarta Uygun Besiyeri ve Metod Seçimi
ISO 4833-2:2013, toplam mezofilik aerobik analizinde 30 oC'ta 72 ±3 saat süreyle aerobik inkübasyon önermektedir. Bu şekilde gıdanın genel mikrobiyolojik kalitesi hakkında bilgi edinilir.(1)
FDA; inkübasyon sıcaklığını 35 ± 1°C’de 48 ±2 saat, süt ürünlerinde ise 32 ±1 oC olarak belirlemiştir.(2)
İçme ve kullanma sularının "toplam jerm" analizi; TS EN ISO 6222'ye göre dökme plak yöntemiyle yapılır. Bu amaçla Yeast extract agar acc. to ISO 6222 besiyeri kullanılır. İnkübasyon parametreleri, 37 oC’ta 24 saat ve 22 oC’ta 72 saat aerobik inkübasyon şeklindedir. İnsani tüketim amaçlı sularla ilgili yönetmelikte, ayrı ayrı olmak üzere, 22 ve 37 oC'ta yapılacak inkübasyon sonrasında elde edilecek koloni sayısının yönetmelikte verilen sınırlar içinde olması istenmektedir. Bu sıcaklıklarda yapılan inkübasyondan sonra bunlardan herhangi birisinde diğerine kıyasla daha fazla ya da daha az koloni sayısı elde edilmesi mümkündür. Aynı kaynak suyu numunesinde yapılan analizlerde bir gün 22 oC'taki koloni sayısı 37 oC'ta elde edilen sayından fazlayken, ertesi gün yapılan analizlerde bunun tersi sonuç alınabilir. ISO 6222'ye aykırı olmakla birlikte, toplam koloni sayımı da membran filtrasyon yöntemi ile yapılabilir. Bu amaçla, filtrasyon hunisine önce ~40 mL steril saf su aktarılır, analiz edilecek su numunesinden 1 mL eklenir ve filtrasyon sonrasında filtre, genel içerikli bir besiyerine yerleştirilir. (1)
Düşük sıcaklık derecelerinde gelişen psikrofil ve psikrotrof bakterilerin sayımı ISO 17410:2001'e göre yapılır. Günlük ve standart uygulamada inkübasyon sıcaklığı 6,5 oC ve süre 10 gündür. 4,5 oC’ta 14 günlük inkübasyon da uygulanmaktadır. (1)
Termofil aeroplar için farklı standartlar, 50-55 oC’ta 48-72 saat inkübasyon önermektedir. Çoğu literatür termofilik aeropları düz ekşime etmeni basiller olarak tanımlamakta ve farklı besiyerleri önermektedir. Termofil aeropların analizinde uygulanan 50-55 oC’ta 48-72 saat inkübasyon sırasında agarlı besiyerine kurumaya bağlı olarak gerçekte olandan daha az sayıda koloni elde edilmesi mümkündür. Bu olumsuzluk, besiyerinin ~20 mL dökülmesi ve/veya ekimi yapılmış petri kutularının mutfak tipi streç filme sarılarak inkübasyona bırakılması ile önlenebilir. (1)
Halofil karakterli olan ve gelişmeleri için mutlak olarak tuza gereksinim duyan bakteriler ile halotolerantların sayımında plate count agar besiyerine amaca uygun olarak %2-8 NaCl eklenir ve standart yöntemle sayım yapılır. Aerobik koloni sayımı standart olarak koloni sayımı ile yapılır. Özel durumlarda ya da araştırmalarda istenirse diğer sayım yöntemleri de (EMS, membran filtrasyon vb.) kullanılabilir. (1)
2.2. Standart Yayma Plak Yöntemi ile Sayım
Homojenizasyon ve/veya gerekli ise seyreltmeler için süt ve ürünlerinde tercihen ¼ Ringer çözeltisi, diğer gıdalarda maximum recovery diluent (MRD) kullanılır. Sıvı gıdalar ise doğrudan analiz edilebilir. (1)
Eğer analiz edilen numunede petri kutusunun yüzeyini kaplayacak şekilde yayılma yapan bakteriler olduğundan kuşkulanılıyor ise ekimden sonra PCA üzerine 45 oC’ta tutulan 4-5 mL su, agar besiyeri dökülür ve bu uygulama analiz raporunda belirtilir. (1)
Gıdalarda toplam mezofil aerop bakteri sayımı sırasında gıda partikülleri ile bakteri kolonilerinin karışmasını önlemede en etkin yöntem, 45 oC'a soğutulmuş 100 mL plate count agar besiyerine %0,5 derişimdeki 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) çözeltisinden 1 mL eklemektir. TTC eklenen PCA besiyerinde koloniler kırmızı pigmentli olur ve kolaylıkla gıda partiküllerinden ayrılır. Bu yöntem, kırmızı partiküllü gıdalara uygulanamaz. (1)
PCA Agar besiyerine analiz edilecek numuneden steril pipetle 0,1ml alınarak besiyeri üzerine aktarılır. Steril cam çubuk (drigalski spatula) kullanılarak numunenin besiyeri yüseyine düzgünce yayılması sağlanır. Sayım sonucunun güvenirliğini arttırmak amacıyla; 100 - 10-1 ve 10-2 şeklinde seyreltmeler yapılarak, bu seyreltmelerden 2’şer petriye 1’er ml’lik ekimler yapılması önerilebilir. Numunenin bakteriyel yükünün düşük olması bekleniyorsa; numuneden 1ml ve 0,1ml (10-1) şeklinde ekimler yapılabilir. Numunenin bakteriyel yükünün fazla olması bekleniyorsa; 0,1ml (10-1) -0,01ml (10-2) ve 0,001ml (10-3) şeklinde ekimler yapılması tercih edilmelidir.
Seyreltmeler iyice çalkalanarak karıştırılmalıdır. FDA’ya göre; 30cm’lik bir yay çizecek şekilde 7sn’de 25 defa olacak hızda çalkalanmalıdır. Eğer dilusyonlar, ekim öncesi 3dk’dan fazla beklerse bu çalkalama işlemi tekrar edilmelidir. (2)
İşlem aşamaları(3);
10g gıda maddesi tartılır ve 90ml fizyolojik su içine konur. Bu karışım stomacher veya blenderde homojenize edilir. Bu dilüsyon -1 (10-1) dilüsyonudur.
10-1 dilüsyonundan 1ml alınır ve içinde 9ml fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu 10-2 dilüsyonudur.
10-2 dilüsyonundan 1ml alınarak 9ml fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu 10-3 dilüsyonudur.
Üzerlerine seyreltim değerleri yazılmış petri kutularına 10-1 , 10-2 , 10-3 dilüsyonlarından 1‟er ml konulur. Petrilerin üzerindeki numaralar seyreltim numaraları ile aynı olmalıdır.
Analizin amacına göre (ör: fakultatif anaeroblar incelenmek istebiyorsa) gerekli görülürse; katı besiyeri sıcak su banyosunda eritilir, 45 oC‟a kadar soğutulur. Her petriye 10-12 ml besiyeri dökülür. Agar katılaşmadan hemen, petri kutularına düz bir yüzey üzerinde üç kez sekiz hareketi çizdirilerek ya da kutulara saat yönünde 3, daha sonra da aksi yönde 3 defa döndürme hareketi yaptırılarak örnek ile besiyerinin homojen karışımı sağlanır.
Kapağı kapatılan petri kutusu, besiyeri katılaşıncaya kadar bekletilir.
Aynı besiyeri sterilite kontrolü için steril iki tane boş petri kutusuna ayrı ayrı dökülür ve agarın katılaşması beklenir.
Ortamda sporlu bakterilerin bulunmasından şüphelenildiğinde, besiyeri üzerine ikinci bir kat besiyeri dökülerek bu grup bakterilerin neden olabileceği olumsuzluklar da ortadan kaldırılabilir. İkinci kat besiyeri ekim yapılan birinci kat besiyerinin üstünü kaplamak ve fakültatif anaerop mikroorganizmaların gelişebileceği anaerop koşulları yaratabilmek için kullanılmaktadır. Çoğunlukla birinci ve ikinci kat besiyerleri aynıdır. Örneğin koliform grubu bakteriler, her iki katta da Violet Red Bile Agar‟ın kullanıldığı çift tabakalı dökme plak yöntemiyle sayılabilir.
Kapakta yoğunlaşan su damlacıklarının besiyeri üzerine damlamasını önlemek için petri kapları kapakları alta gelecek şekilde ters çevrilerek önerilen sıcaklıkta ve sürede inkübe edilir.
Her bir ekim yapılan petride sayılan kolonilerden; numunenin 1ml’sindeki ortalama koloni sayısının hesaplanmasında şu formül uygulanır; N = ∑C / [ V x (n1 + 0,1 xn2 ) x d ) ]
N = 1g (mL) miktarındaki koloni sayısı
C = Sayımı yapılan tüm petri kutularındaki toplam koloni sayısı
n1 = İlk dilüsyondaki sayımı yapılan petri sayısı
n2 = İkinci dilüsyondaki sayımı yapılan petri sayısı
d = Birinci dilüsyonun seyreltme oranı (1) (2)
Petri kutusunda yayma ve dökme kültürel ekim yöntemlerinde değerlendirmeye alınması gereken koloni sayısı konusunda farklı yaklaşımlar vardır. Petri kutusundaki koloni sayısının istatistiksel olarak güvenli kabul edilmesi için şu aralıklar ifade edilmektedir; 25-250 , 30-300 ve 15-250 adet kob/Petri. (1)
Maya ve özelikle küf sayımında koloni çapı dikkate alındığında farklı standartlara erişilebilir. Genellikle 15-150 kob/ Petri kutusu kabul edilir. (1)
FDA, VRB Agar besiyerinde koliform grup bakteri sayımında 1-154 adet koloni sayısını benimsemiştir(1)
FDA; toplam aerobik koloni sayımı için uygun aralık olarak 25-250 sayısını kabul etmektedir. (2)
Ortalama olarak 1 cm2 alanda 5-10 arasında koloni varsa koloni sayacı kullanılarak yatay ve düşey olarak 1 cm2 olan 6'şar eksende sayım yapılıp ortalaması alınır ve Petri kutusu alanı ile orantı kurularak sayım sonucu hesaplanır. 1 cm2 alanda 10'dan fazla koloni varsa herhangi 4 alanda sayım yapılıp ortalama alınır ve yine Petri kutusu alanı ile orantı kurularak sonuç bulunur. Her iki koşulda da sonuç, "tahmini" olarak verilir. (1)
Koloni sayısının hesaplanmasında sıklıkla karşılaşılan bir soru aynı seyreltiden 2 paralel ekim yapıldığında sayım sonuçları arasındaki farktır. Genel olarak % 0-10 farklılık "çok iyi", %10-15 farklılık "iyi" ve %15-20 farklılık "kabul edilebilir" olarak değerlendirilmektedir. Daha yüksek koloni sayısı farklılıkları görülüyor ise bunun nedenleri sistematik olarak araştırılmalı ve farkın aşağıya çekilmesi için düzeltici uygulama yapılmalıdır. (1)
Burada dikkati çeken bir ayrıntı vardır. 2 paralel ekimde 80 ve 100 koloni sayımı elde edildi ise tolerans hesabında hangi sayının dikkate alınacağı tartışılmalıdır. 80 koloni dikkate alınırsa bunun %20 fazlası 96 olup kabul edilebilir sınırın dışındadır. Oysa 100 koloni esas alınırsa bunun %20 eksiği 80 olup bu kez kabul edilebilir sınır içindedir. Analiz yapan kişinin lehine olarak büyük değer esas alınabileceği gibi analiz sonucunun daha duyarlı olması açısından küçük değer de dikkate alınabilir. Bu konu ilgili talimatta açık bir şekilde belirtilmelidir. (1)
FDA; koloni hesaplamasında hayali bir kesinlik ve doğruluk izlenimi yaratmaktan kaçınmak için yalnızca ilk iki basamağın yazılmasını, diğer basamkların yuvarlanmasını önermektedir (ör; 12.700 ise; 13.000, 12.400 ise 12.000 olarak raporlanmalıdır). (2)
Sayımda dikkat edilmesi gereken bir diğer özellik, performans testidir ve ayda en az bir kez yapılması önerilir. Buna göre sayım yapan personelin aynı Petri kutusunda bir kez daha sayım yapması sağlanır. 2 sonuç arasında kabul edilebilecek en yüksek fark %8'dir. Aynı Petri kutusunda 2 ayrı personelin sayım sonuçları arasında ise en çok %10 fark kabul edilebilir. Bu şekilde personelde performans düşüklüğü fark edilirse düzeltici önlem alınmalıdır. (1)
İnkübasyon sonunda petri kutularında sayım hızla yapılmalıdır. Herhangi bir nedenle inkübasyon sonrasında sayım yapılamayacak ise petri kutuları buzdolabında (+5 ±3) oC'ta en fazla 24 saat depolanabilir.(1)
YARARLANILAN KAYNAKLAR
(1) HALKMAN A. Kadir, Gıda Mikrobiyolojisi, 2019. Editör: A. Kadir Halkman. Başak Matbaacılık ve Tanıtım Hizmetleri Ltd, 648 s. ISBN: 978-605-245-683-5, Ankara.
(2) https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count
(4) TS EN ISO 4833-1, Mikroorganizmaların sayımı için yatay yöntem -Bölüm 1: Dökme plak tekniğiyle 30°C’ta koloni sayımı
(5) TS EN ISO 4833-2, Mikroorganizmaların sayımı için yatay yöntem - Bölüm 2: Yayma plak tekniğiyle 30°C’ta koloni sayımı